نحوه کار با محیط آگار

1- هدف:

افتراق انتروباكترياسه ها، افتراق بين گونه هاي بروسلا، شناسايي گونه هاي مهمي نظير كورينه باكتريوم اوره آ ليتيكوم ، هليكوباكترپيلوري ، تشخيص مخمرهاي كپسولدار و به عنوان يك تست اضافي براي تشخيص بعضي كوكوباسيل هاي گرم منفي

2- اساس آزمايش:

اوره آز آنزيمي است كه بعضي از ارگانيسم ها آن را توليد كرده و اوره را به دي اكسيد كربن، آب و آمونياك هيدروليز مي كنند. آمونياك در محلول به كربنات آمونيوم تبديل شده و باعث قليايي شدن محيط و بالا رفتن pH مي شود.

3- نمونه اوليه:

كشت 24 – 18 ساعته از ارگانيسم مورد نظر

4- مواد و تجهيزات مورد نياز:

محيط كشت مايع نظير Stuart’s urea broth يا محيط كشت آگار مانند Christensen’s urea Agar

5- مراحل انجام كار:

5-1 ) محيط كشت Broth يا سطح شيبدار محيط كشت جامد را با مقدار نسبتاً زيادي از كلني هاي ايزوله تلقيح مي كنيم.

5-2 ) هر دو لوله محيط كشت را با در پيچِ شل به مدت 48 ساعت تا هفت روز در 0C 35 انكوبه مي نماييم. ارگانيسم هايي كه اوره را سريع هيدروليز مي كنند، در عرض 2-1 ساعت واكنش مثبت مي دهند و سويه هايي كه كمتر فعالند، به 3 روز يا بيشتر انكوباسيون نياز دارند.

5-3 ) واكنش ها بدين صورتند :

a. اوره Broth :

- ايجاد رنگ قرمز نشان دهنده واكنش قليايي و هيدروليز اوره مي باشد.

.b اوره آگار:

- سوش هاي اوره آز مثبت سريع : ايجاد رنگ قرمز در تمام محيط

- سوش هاي اوره آز مثبت ضعيف : ايجاد رنگ قرمز ابتدا فقط در سطح و بتدريج در عمق لوله

- سوش هاي اوره آز منفي : محيط كشت به رنگ اوليه خود باقي مي ماند.

6- برنامه QC :

هر batch جديد از محيط كشت بايد با ارگانيسم هاي كنترل مثبت و منفي تست شود.

سوش كنترل مثبت: Proteus sp

سوش كنترل مثبت ضعيف: Klebsiella sp

سوش كنترل منفي : E. coli

توجه:

بايد به اهميت تفاوت محيط كشت اوره Broth و اوره آگار توجه شود. از آنجا که اوره Broth حاوي مقدار زيادي از بافر نمك هاي فسفات با 8/6 = pH مي باشد برای از بين بردن اثر بافر بايد مقدار نسبتا زيادی آمونياک توسط باکتری ايجاد شود تا pH محيط به بالاي 8 برسد و تغيير رنگ ايجاد شود.

محيط اوره آگار حاوي مقدار كمتري بافر نسبت به اوره Broth مي باشد و پپتون و گلوكز دارد. اين محيط غني بوده و رشد بسياري از باكتري هايي را كه نمي توانند در اوره براث رشد كنند، افزايش مي دهد. از طرفي کم بودن مقدار بافر در اوره آگار اجازه مي دهد كه مقدار كم آمونياك حاصل از هيدروليز اوره توسط باكتري هاي اوره آز ضعيف، مشخص شود. باكتري هايي كه اوره آز كمي ايجاد مي كنند مثل گونه هايي از كلبسيلا و آنتروباكتر و بروسلا در محيط اوره آگار، تست مي شوند.

نظرات شما عزیزان: